Metodología de análisis proteómico
La matriz que utilizamos en la primera parte de nuestra investigación, el fluido cervicovaginal, es una muestra muy compleja de estudiar. Hemos trabajado varios meses para obtener una técnica estandarizada, robusta y reproducible, lo que hoy nos permite obtener muy buenos resultados, alrededor de 6000 a 8000 proteínas por muestra.
Nuestra metodología en el laboratorio de proteómica comienza una vez que se toma la muestra de la voluntaria, se le incorporan inhibidores de proteasas y se congela a -80ºC hasta su procesamiento. Una vez que se analizará la muestra, ésta se descongela y se extraen las proteínas utilizando diferentes agentes caotrópicos, en distintos tampones y pH, donde finalmente se utiliza un método basado en Urea con Carbonato de Amonio. Posteriormente las proteínas son sometidas a evaluación de calidad por SDS-PAGE y sometidas a Clean Up y digestión; los péptidos son cuantificados e inyectados al nanoHPLC (nanoELUTE, Bruker) para su separación cromatográfica, éste equipo está conectado en línea con el espectrómetro de masas timsTOF Pro de Bruker, el cual colecta la información en base a la metodología de DDA (Data Dependent Adquisition).
Una de las estrategias que hemos implementado en el laboratorio es el fraccionamiento off-line, el cual nos permite realizar Deep Proteomics, donde obtenemos una gran profundidad de identificación de proteínas y una gran cobertura de péptidos; para ello, los péptidos antes de ser analizados en el espectrómetro de masas, son sometidos a un fraccionamiento cromatográfico, utilizando la estrategia de pH Reversa a través del cromatógrafo AKTA Avant 25â de General Electric, donde colectamos un numero de fracciones dependiendo del experimento y la profundidad requerida, que pueden ser de 8 a 24 fracciones, cada fracción es separada nuevamente en el nanoHPLC y los datos son analizados en el espectrómetro de masas.
La información medida por el timsTOF Pro es analizada con softwares como PEAKS Studio X, el cual traduce la información experimental desde el espectrómetro a secuencias de péptidos y proteínas con sus respectivos valores de intensidad relativa, los cuales son re-analizados utilizando aplicaciones basadas en el lenguaje R, utilizando el paquete bioconstructor, donde se realizan análisis cuantitativos y estadísticos, generando graficas como heatmap, volcano plots y listados de proteínas de expresión diferencial estadísticamente significativos.
El equipo de análisis
Para realizar proteómica profunda se realiza un fraccionamiento offline en un cromatógrafo AKTA AVANT, que es un HPLC que permite separar los péptidos en fracciones más simples. Cada una de estas fracciones se inyectan en el espectrómetro. Adicionalmente, contamos con el Direct Detect que es un espectrómetro infrarrojo que permite determinar la cantidad de péptidos que hay en la muestra.
También utilizamos un equipo de florescencia para la cuantificación de proteínas que se llama Qubit, que nos permite conocer la concentración de proteínas y, a su vez, todo lo relativo a la calidad de las proteínas.
Contamos con un sistema electroforesis que se componen de una cámara y una fuente de poder de marca BIORAD, el SpeedVac que nos permite hacer la concentración rotatoria de los péptidos y finalmente el espectrómetro de masas Tims TOF Pro, de Bruker, con su Nano HPLC (nanoELUTE).-
El espectrómetro puede funcionar por sí solo, pero no tendría la gran performance que tiene sin el Nano HPLC, porque de una muestra muy compleja sólo podría resolver lo más abundante; por lo tanto la cromatografía lo que hace es separar tu muestra e ir dejando que vayan ingresando péptidos de uno por uno o de grupo de péptidos al espectrómetro. Por ejemplo: si se toma una muestra compleja que tiene miles de péptidos y la inyectas al espectrómetro solo, va detectar únicamente los más abundantes que serán 100 o 200, en cambio, con el Nano HPLC acoplado puedes resolver miles.-
Software
Tras obtener un resultado del espectrómetro de masas se utiliza un motor de búsqueda para el análisis. En este caso tenemos varios algoritmos; principalmente utilizamos PEAKS estudio X+, pero también utilizamos para otros experimentos MaxQuant, MS Fragger dependiendo el tipo de aplicación.
El motor de búsqueda entrega las secuencias de los péptidos/proteínas además de los valores de abundancia relativa y los conteos espectrales y esos datos los llevas a un software estadístico. En este caso, se trabaja con R y con una aplicación que se llama Bio Conductor, donde se puede hacer la normalización a los resultados en base a las medias. Para que los resultados sean comparables, posteriormente hacemos las comparaciones en veces de cambio. ¿Qué significa esto? Transformamos los datos en función del logaritmo 2, versus un control de una división. Con eso tenemos datos cuantitativos. Y luego utilizamos software de análisis de pathway como el software IPA.-